骨髓增生异常综合症

234例骨髓增生异常综合征患者U2AF1基因突变位点、突变负荷及共突变基因的临床特征分析

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234例骨髓增生异常综合征患者U2AF1基因突变位点、突变负荷及共突变基因的临床特征分析

王海琼 郭荣   通信作者:郭荣,Email:gh7311@aliyun.com

【摘要】 目的 探讨U2AF1基因的突变位点、突变负荷及共突变基因在骨髓增生异常综合征(MDS)患者中的发生情况及对预后的影响。方法 回顾性收集234例MDS患者的临床资料,分析U2AF1 基因突变的临床特征、疗效和预后。结果 234例MDS患者中,U2AF1基因突变率为21.7%(51例),中位等位基因频率(mVAF)为39.46%,相较野生型基因,U2AF1突变者的8号染色体异常发生率增加,且U2AF1基因突变与ASXL1、RUNX1、SETBP1基因突变的发生呈正相关,与SF3B1基因突变相斥(P<0.05);U2AF1基因最常见的突变位点为S34F(32例),U2AF1的Q157P位点突变者7号染色体异常发生率较高(P=0.003),易合并信号通路相关基因突变(P=0.043),OS有缩短趋势;在U2AF1基因突变患者中,合并ASXL1突变者易进展为急性髓系白血病(AML),合并RUNX1突变者复发风险增加,合并TET2突变者1年生存率有增加趋势;相较于U2AF1突变负荷较低组(VAF≤40%),U2AF1突变负荷相对较高组(VAF>40%)的1年生存率明显降低(41.3%和76.9%,P=0.031),且U2AF1的VAF>40%为MDS患者预后不良的独立影响因素;结论 在MDS中患者,U2AF1的Q157P位点突变者和U2AF1的突变负荷较高者均提示预后可能不佳,U2AF1的共突变基因可能影响疾病进展及预后。

【关键词】 骨髓增生异常综合征;U2AF1基因;基因突变;等位基因频率;预后分析

基金项目:国家自然科学基金 (81070445);河南省自然科学基金(182300410301); 河南省医学科技攻关计划(201403029)

骨髓增生异常综合征 (myelodysplastic syndrome,MDS)是一组以骨髓无效造血、病态造血和高风险转化为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia ,AML)为特征的恶性克隆性造血干/祖细胞疾病。70%-90%左右的MDS患者可检测出1种及其以上的基因突变[1],多项研究证实基因突变在MDS的发生、发展、治疗及预后中起着重要作用[2-4]。U2AF1作为RNA剪切相关基因突变,是MDS的早期驱动基因[6]。目前U2AF1对预后影响暂不明确,有研究显示,U2AF1突变对预后无影响[7-9],另有部分研究显示U2AF1突变者预后不良[10-12]。而有研究显示U2AF1的突变位点可能影响预后,其中Q157突变者预后较S34差[12-14]。突变基因逐步累积可促进MDS的发生和进展,因此,MDS的预后可能与通过累积而产生不同的共突变基因组合相关[15];本研究通过随访234例MDS患者,探讨U2AF1的突变位点、突变负荷和共突变基因在MDS的临床意义。

材料与方法

1. 研究对象:回顾性收集2016年1月至2020年1月于我院血液科就诊的234例MDS患者。纳入标准:①符合骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识(2016 版)临床诊断标准,且为原发性MDS患者;②初诊时二代基因测序检查者;③年龄大于16岁;按照WHO(2016)MDS诊断和分型标准,MDS伴单系病态(MDS-SLD)17 例(7.3%),MDS伴多系病态(MDS-MLD)52例(22.2%),MDS伴原始细胞增多1型(MDS-EB1)51例(21.8%),MDS伴原始细胞增多2型(MDS-EB2)98例(41.9%),MDS伴环形铁粒幼细胞(MDS-RS)10例(4.3%),MDS伴单纯5q-异常(MDS(5q-))4例(1.7%),MDS未分类(MDS-U)2例(0.9%);因本研究中MDS(5q-)和MDS-U患者例数较少,均将其归入为MDS-RS组16例(6.9%);参照修订后国际预后评分系统(IPSS-R),205例有染色体核型结果的MDS患者进行IPSS-R分层,因极低危组例数仅2例,将其归类为低危组(极低危组+低危组)为32例(15.6%),中危组54例(26.3%),高危组70例(34.2%),极高危组43例(23.9%);MDS根据预后积分系统分为相对较低危组(IPSS-R分数≤3.5分)和相对较高危组(IPSS-R分数>3.5分),分别为47例(22.9%)和158例(77.1%);

2. 二代测序检查方法:利用PCR技术,进行基因扩增,PCR产物进行基因测序;基于合成测序(SBS)技术,采用Illumina 高通量MiSeq测序平台检测22项MDS相关基因。对于长度大于150bp的基因,如FLT3-ITD,采用另一种RT-PCR方法进行分析;根据COSMIC数据库及文献报道确定致病性突变位点。

3. 治疗方法:234例MDS患者中,212例MDS患者进行治疗,67例接受去甲基化药物治疗(HMA)者,85例应用HMA联合预激治疗,60例其他治疗组(包括支持治疗和单纯化疗);共152例应用HMA治疗,13例先后应用地西他滨(DEC)和阿扎胞苷(AZA)治疗,5例单用AZA治疗,134例单用DEC治疗;在134例DEC治疗患者中,低剂量组(DEC剂量为6-8mg/m2/d)60例,高剂量组(DEC剂量为12-15mg/m2/d)74例;此外,根据是否合并化疗分为:DEC治疗组58例,DEC+化疗组76例;

4. 治疗与疗效标准:主要参照骨髓增生异常综合征(MDS)国际工作组(IWG)疗效标准;总体反应率(ORR)包括药物治疗2-6疗程后评估为完全缓解(CR)、骨髓完全缓解(mCR)、部分缓解(PR)和血液学缓解(HI)之和。

5. 随访:本研究采用门诊和住院部就诊病历资料随访及电话随访,随访起点为MDS的确诊日期,随访终点为该研究随访截止时间(2020.2.1)、死亡时间和失访时间。截止随访日期,234例MDS患者的中位生存期(mOS)为189(2-1406)天,其中99例存活(42.3%),90例死亡(38.5%),45例失访(19.2%)。总生存期(Overall survival,OS)的定义是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。若随访日期结束,患者仍存活,总生存期的终点时间为随访截止时间(2020.2.1)。

6. 统计学分析:应用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析,计数资料采用卡方检验或 Fisher确切概率法,计量资料和等级资料采用非参数检验,非正太分布资料采用Spearman相关性分析,Logstic回归分析进行多因素分析;采用K-M法进行生存分析,Log-rank检验比较组间差异,生存分析中有意义的指标进行COX回归分析;认为P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1. 临床特征

234例MDS患者中,男性142例(60.6%),女性92例(39.4%);中位年龄为55(17~86)岁;初诊时中位骨髓原始细胞比例为6.0(0~18.8)%×10^9/L,外周血白细胞(WBC)计数为2.5(0.02~20.3)×10^9/L,中性粒细胞(N)计数为0.95(0~17.7)×10^9/L,血红蛋白浓度为(HGB)为71(24~145)g/L,血小板计数(Plt)为49(3~745)×10^9/L;随访期间32例(13.6%)出现复发,36例(15.3%)进展为急性髓系白血病(AML);212例治疗患者中的ORR为30.7%(65例),134例DEC治疗患者中的ORR为31.6%(48例);

2. 突变基因检测

234例患者中,总突变基因个数为347个,72.2%(169例)的患者出现至少1个基因突变,突变基因个数的中位数为2(1~6)个,89例患者存在2个及其以上的突变基因;U2AF1突变51例(21.7%),共检出52个突变位点,2号外显子突变43例(84.3%),其中32例(62.7%)U2AF1突变的蛋白序列为第34位丝氨酸被苯丙氨酸替代[ S34F rs371769427(后均简称为:S34F)],11例(21.6%)为第34位丝氨酸被酪氨酸替代[ S34Y ];7例(13.7%)6号外显子突变者均为第157位谷氨酸被脯氨酸替代[ Q157P ],1例同时检出S34F和Q157P两位点突变,51个突变位点的中位等位基因频率(mVAF)为39.46%(1.38%~49.02%),均为杂合子突变;39例(76.5%)U2AF1突变存在共突变基因,U2AF1常见的共突变基因依次为ASXL1(33.3%,17例)、TET2(31.4%,16例)、RUNX1(21.6%,11例)、SETBP1(11.8%,6例)。

3. U2AF1突变的临床特征及预后分析

相较于U2AF1未突变组,U2AF1突变组的8号染色体异常发生率增加(22.4%和10.3%,P=0.028),20号染色体异常发生率偏高(16.3%和7.7%,P=0.097),中性粒细胞绝对值下降(N中位数(10^9/L):0.76和1.03,P=0.05);U2AF1与ASXL1、RUNX1、SETBP1基因突变呈正相关,与SF3B1基因突变相斥(P<0.05);而两组间复发率、进展为AML风险、对DEC的治疗反应、OS(中位OS:514天和719天,P=0.286)均无显著差异;

4. U2AF1突变位点的临床特征及预后意义

相较于S34F和S34Y突变,U2AF1的Q157P位点突变者7号染色体异常发生率较高(P=0.003),年龄偏大,IPSS-R危险分层多为相对高危组,血红蛋白浓度偏低,5号染色体异常和复杂核型的发生率均较高,但差异无统计学意义(P>0.05),OS有缩短趋势(S34F、S34Y和Q157P的mOS:628天、804天和184天,P=0.267),U2AF1三突变位点间的中位等位基因频率(P=0.206),且对DEC的治疗反应(P=0.650)、复发风险(P=0.760)、进展为AML的风险(P=1.000)无显著差异;S34F、S34Y和Q157P氨基酸突变位点的合并突变率分别为72.7%、72.7%和100%,S34Y位点突变者合并2个共突变基因的发生率高于S34F和Q157P氨基酸突变位点(P<0.05);相较于S34F和S34Y突变,U2AF1的Q157P位点突变者易合并信号通路相关基因突变(P=0.043),且与TP53基因共突变率较高(S34F、S34Y和Q157P的TP53共突变率:3%、0和28.6%,P=0.076),S34F和S34Y氨基酸位点间共突变基因种类和比例无明显差异;

5. U2AF1与ASXL1、TET2、RUNX1共突变的临床特征及预后分析

⑴ 相较于U2AF1++ASXL1-者,U2AF1++ASXL1+者的初诊骨髓原始细胞比例较高(中位数:5.69%和4.60%,P=0.05),多分布于MDS-EB阶段(76.5%和41.7%,P=0.047),进展为AML的风险更高(29.4%和2.9%,P=0.012),复发率有增加趋势(17.6%和2.9%,P=0.102),2组患者在IPSS-R分组、年龄、性别、对DEC治疗反应及预后等方面无显著差异;

⑵ 相较于U2AF1++TET2-者,16例U2AF1++TET2+者中U2AF1突变负荷较低(mVAF:35.5%和48.2%,P=0.036),1年OS率有增加的趋势(1年OS:66.7%和54.5%,P=0.068),对DEC的ORR率稍高(41.7%和25.0%,P=0.441),但差异无统计学意义;9例U2AF1的S34F位点突变+TET2+者中8例存活,1例失访,提示U2AF1的S34F位点突变伴TET2突变者可能预后更佳;

⑶ 相较于U2AF1++RUNX1-者,11例U2AF1++RUNX1+者中U2AF1的VAF值>40%的发生率较高(72.7%和40.0%,P=0.054),且复发率较高(27.3%和2.5%,P=0.028),2组患者在MDS亚型分布、IPSS-R分组、年龄、性别、对DEC治疗反应、疾病进展及预后等方面无显著差异;

6. U2AF1基因突变负荷的临床特征及预后分析

根据U2AF1突变的mVAF(39.46%)分为U2AF1突变负荷相对较低组(VAF≦40%)和突变负荷相对较高组(VAF>40%)2组;相较于U2AF1突变负荷相对较低组(VAF≦40%),U2AF1突变负荷相对较高组患者多分布于IPSS-R高危组与极高危组中(P=0.045),且7号染色体异常发生率较低(0%和22.2%,P=0.027),与RUNX1合并突变发生率有较高的趋势(33.8%和11.1%,P=0.054),1年生存率明显降低(41.3%和76.9%,P=0.031)(见图1),2组在年龄、性别、对DEC的治疗反应、疾病进展、复发等方面无显著差异;

7. 基因突变与预后

234例MDS患者中,中位生存时间为286天(2~1406天),其中90例(38.5%)死亡,45例(19.2%)失访。单因素分析显示,进展为AML(中位生存时间:447天和802天,P=0.028)、7号染色体异常(中位生存时间:400天和830天,P<0.001)、20号染色体异常(中位生存时间:412天和802天,P=0.047)、EZH2突变(中位生存时间:256天和791天,P=0.005)、TP53突变(中位生存时间:497天和797天,P=0.023),CBL突变(中位生存时间:158天和791天,P=0.038)RUNX1的VAF>40%(中位生存时间:432天和909天,P=0.034)、U2AF1的VAF>40%(1年OS率:41.3%和76.9%,P=0.031)均与较短的OS相关;同时纳入年龄、初诊骨髓原始细胞比例、IPSS-R分层和MDS亚型进行多因素分析,结果显示U2AF1的VAF>40% [HR=3.261,95%CI(1.654~6.430),P=0.001]、7号染色体异常[HR=3.885,95%CI(1.527~5.148),P<0.001]、EZH2突变[HR=8.523,95%CI(2.558~28.395),P<0.001]、TP53突变[HR=4.532,95%CI(1.885~10.895), P=0.001]、CBL突变[HR=4.286,95%CI(1.294~14.193),P=0.017]为OS的独立不良因素。

讨论

U2小核糖核酸辅助因子1基因(U2AF1)为RNA剪切相关基因,是MDS的早期突变基因[6],在MDS患者中U2AF1突变的突变率约有5%到20%[7, 12, 13, 16]。有研究显示[7]在MDS患者中,黄种人的U2AF1突变率高于白种人,且在黄种人中U2AF1突变与8号染色体异常的相关性明显。本研究中234例MDS患者中,U2AF1突变率为21.7%,略高于既往研究,U2AF1突变者8号染色体异常发生率明显增加,20号染色体异常发生率有增加趋势,51例U2AF1突变者的突变位点均为S34与Q157突变,其中S34F突变率最高,以上均与既往研究类似[7, 14],其它研究显示在原发性骨髓纤维化和AML患者中Q157突变率最高[14, 17]。此外,既往研究[7, 12, 14]显示U2AF1突变者易合并贫血、血小板减少,且有研究显示[18]U2AF1的S34F突变者可以通过调节下游靶基因H2AFY和STRAP形成异常剪接导致红细胞生成减少和粒单核细胞分化异常,而本研究显示U2AF1突变者中性粒细胞数偏低,但在三突变位点间无显著差异,考虑样本量过少后期需进一步验证。

目前研究表明,特定的突变和细胞遗传学异常密切相关,并可能通过独特的致病机制促进白血病的发生、发展。在Kim等[7]研究中U2AF1的S34Y突变者与8号染色体异常明显相关,S34F突变者与20号染色体异常相关,Q157突变者的7号染色体异常发生率偏高,后两者相关性在该研究中无统计学差异。而本研究为首次发现相较于S34F、S34Y突变者,Q157P突变者的7号染色体异常发生率明显增加(P=0.003),且信号通路相关基因共突变率较高,与TP53共突变的发生率和进展为AML的风险均较高,且总体生存时间缩短。Zhang等[19]研究显示U2AF1突变可通过下调相关基因转录,从而影响p53信号通路、MAPK信号通路蛋白的表达,因此我们推测U2AF1的Q157P突变可能通过下调某些基因的转录导致遗传学不稳定性和增加某些特定致病意义的基因发生率,从而影响疾病进展和预后。

Li等[15]研究显示初始克隆基因(ASXL1、TET2和DNMT3A)促进MDS的发生,而早期驱动基因(SF3B1, U2AF1 和RUNX1)与MDS的基本临床特征相关且导致某些特殊的驱动基因(BCOR, EZH2 和TP53等)产生,在驱动基因的基础上出现导致晚期分子学事件的基因(信号通路相关基因、转录因子基因、肿瘤抑制相关基因等)可导致疾病进展及对预后产生不良影响,提示MDS的发生和进展是基因突变逐步积累的过程,而共突变基因形式的不同可能对预后产生差异。目前国内外研究多集中于U2AF1突变状态、突变位点以及合并细胞异常学异常的临床特征及对预后影响,较少研究U2AF1与其它共突变基因的临床特征及预后影响。本研究在U2AF1突变患者中通过分别对比合并ASXL1、TET2、RUNX1突变较ASXL1、TET2、RUNX1未突变者的临床特征及预后,试图阐述共突变基因在U2AF1患者中的作用。在本研究中U2AF1突变与ASXL1、RUNX1、SETBP1呈正相关,与SF3B1呈负相关(P<0.05),与既往研究一致[7, 12-14]。不同的突变位点可能存在固定的共突变模式,本研究发现Q157P与信号通路相关基因共突变比例明显高于其它位点,此外,Q157P位点的TP53共突变发生率高于S34位点突变者,与Tefferi等[14]研究一致,该研究显示Q157突变中与TP53、ASXL1、IDH1、SETBP1共突变率高于S34突变者。侯畅等[20]研究显示在U2AF1突变的MDS患者中,合并RUNX1突变者为影响造血干细胞移植的独立不良因素,提示共突变基因类型可能对预后产生影响。而在本研究U2AF1突变患者中,相较于RUNX1未突变组,RUNX1突变组的复发率较高,我们考虑可能与本研究中RUNX1突变组的U2AF1突变负荷较高相关;与此同时,我们发现与ASXL1未突变相比,合并ASXL1突变者的U2AF1突变负荷较高,且初诊骨髓原始细胞比例较高,多分布于MDS-EB阶段,进展为AML的风险更高,复发率有增加趋势;而与TET2未突变组,TET2突变组的U2AF1突变负荷较低,其1年OS率有增加的趋势,对DEC的ORR率稍高,差异虽无统计学意义,但本研究通过观察U2AF1在不同的共突变基因组合中的突变负荷,发现不同的共突变基因可能对U2AF1的突变负荷存在一定的影响,从而通对疾病进展及预后产生作用。

目前U2AF1突变对预后影响尚不明确,部分研究显示U2AF1突变对预后无影响[7-9],另有部分研究显示U2AF1突变者预后不良[10-12]。最近几项研究显示不同的U2AF1的突变位点间预后存在差异,U2AF1的Q157突变者预后较S34差[12-14];在本研究中Q157P的OS有缩短趋势(S34F、S34Y和Q157P的mOS:628天、804天和184天,P=0.267),但差异不显著,后期需扩大样本量验证。此外,有研究显示TET2、TP53的突变负荷对总体生存时间存在影响[21-23],目前较少研究报道U2AF1的突变负荷对预后的影响,在本研究中发现相较于U2AF1突变负荷相对较低组(VAF≦40%),U2AF1突变负荷相对较高组(VAF>40%)患者1年生存率明显降低(41.3%和76.9%,P=0.031),2组在年龄、性别、对DEC的治疗反应、疾病进展、复发等方面无显著差异,考虑其较差的预后可能与IPSS-R分组中多为高危组与极高危组(P=0.045)以及其合并RUNX1突变的发生率较高相关,在既往研究中RUNX1突变者多易进展为AML且预后不良[24, 25]。本研究中多因素分析首次证实U2AF1的VAF>40%是MDS患者较短的OS的独立影响因素,进一步验证上文U2AF1在与TET2、ASXL1、RUNX1共突变时U2AF1突变负荷对疾病进展及预后的影响。未来需进一步研究共突变基因与突变负荷间关系,以及其在疾病进程及预后的作用。

总之,本研究结果显示U2AF1的Q157位点突变者多提示预后不佳,U2AF1的VAF>40%是MDS患者较短的OS的独立影响因素。


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